Transcripción inversa intracelular de la vacuna de ARNm BNT162b2 de Pfizer BioNTech COVID-19 in vitro en una línea celular de hígado humano.

Por Markus Aldén 1ORCID, Francisko Olofsson Falla 1, Daowei Yang 1, Mohammad Barghouth 1, Cheng Luan 1, Magnus Rasmussen 2 y Yang De Marinis 1,*ORCID

Recibido: 18 de enero de 2022 / Revisado: 19 de febrero de 2022 / Aceptado: 23 de febrero de 2022 / Publicado: 25 de febrero de 2022.

Abstracto

Los estudios preclínicos de la vacuna de ARNm de COVID-19 BNT162b2, desarrollada por Pfizer y BioNTech, mostraron efectos hepáticos reversibles en animales que recibieron la inyección de BNT162b2. Además, un estudio reciente demostró que el ARN del SARS-CoV-2 puede transcribirse de forma inversa e integrarse en el genoma de las células humanas. En este estudio, investigamos el efecto de BNT162b2 en la línea celular de hígado humano Huh7 in vitro. Se expusieron células Huh7 a BNT162b2 y se realizó una PCR cuantitativa en el ARN extraído de las células. Detectamos altos niveles de BNT162b2 en células Huh7 y cambios en la expresión genética del elemento nuclear 1 intercalado largo (LINE-1), que es una transcriptasa inversa endógena. La inmunohistoquímica que utiliza la unión de anticuerpos a la proteína de unión a ARN del marco de lectura abierto 1 (ORFp1) de LINE-1 en células Huh7 tratadas con BNT162b2 indicó una mayor distribución del núcleo de LINE-1. La PCR en ADN genómico de células Huh7 expuestas a BNT162b2 amplificó la secuencia de ADN exclusiva de BNT162b2. Nuestros resultados indican una rápida absorción de BNT162b2 en la línea celular de hígado humano Huh7, lo que lleva a cambios en la expresión y distribución de LINE-1. También mostramos que el ARNm de BNT162b2 se transcribe de forma inversa intracelularmente en ADN en tan solo 6 horas tras la exposición a BNT162b2.

1. Introducción

La enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), causada por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), fue anunciada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como pandemia mundial el 11 de marzo de 2020 y surgió como una crisis de salud devastadora. Hasta febrero de 2022, COVID-19 ha provocado más de 430 millones de casos de infección notificados y 5,9 millones de muertes en todo el mundo [1]. Se necesitan con urgencia vacunas eficaces y seguras para reducir las tasas de morbilidad y mortalidad asociadas con la COVID-19.

Se han desarrollado varias vacunas para COVID-19, con especial atención a las vacunas de ARNm (de Pfizer-BioNTech y Moderna), vacunas de vectores adenovirales recombinantes con replicación defectuosa (de Janssen-Johnson y Johnson, Astra-Zeneca, Sputnik-V y CanSino ) y vacunas inactivadas (de Sinopharm, Bharat Biotech y Sinovac). La vacuna de ARNm tiene las ventajas de ser flexible y eficiente en el diseño y fabricación de inmunógenos y, actualmente, numerosas vacunas candidatas se encuentran en diversas etapas de desarrollo y aplicación. Específicamente, la vacuna de ARNm contra el COVID-19 BNT162b2 desarrollada por Pfizer y BioNTech ha sido evaluada en ensayos clínicos exitosos [2,3,4] y administrada en campañas nacionales de vacunación contra el COVID-19 en diferentes regiones del mundo [5,6,7,8 ].

BNT162b2 es una vacuna de ARN modificada con nucleósidos (modRNA) encapsulada en nanopartículas lipídicas (LNP) y codifica la longitud completa de la proteína pico (S) del SARS-CoV-2, modificada por dos mutaciones de prolina para garantizar una conformación previa a la fusión antigénicamente óptima, que imita el virus intacto para provocar anticuerpos neutralizantes del virus [3]. De acuerdo con los ensayos clínicos aleatorios, BNT162b2 mostró una alta eficiencia en una amplia gama de resultados relacionados con COVID-19 en un entorno del mundo real [5]. Sin embargo, aún quedan muchos desafíos, incluido el seguimiento de la seguridad y eficacia a largo plazo de la vacuna. Esto justifica más evaluaciones e investigaciones. Actualmente, el perfil de seguridad de BNT162b2 solo está disponible en estudios clínicos a corto plazo. Se han informado efectos adversos menos comunes del BNT162b2, que incluyen pericarditis, arritmia, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto de miocardio, hemorragia intracraneal y trombocitopenia [4,9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20]. También hay estudios que reportan efectos adversos observados en otro tipo de vacunas [21,22,23,24]. Para comprender mejor los mecanismos subyacentes a los efectos adversos relacionados con las vacunas, se necesitan investigaciones clínicas y análisis celulares y moleculares.

Un estudio reciente demostró que los ARN del SARS-CoV-2 pueden transcribirse de manera inversa e integrarse en el genoma de las células humanas [25]. Esto plantea la pregunta de si esto también puede ocurrir con BNT162b2, que codifica parte del ARN del SARS-CoV-2. En los datos farmacocinéticos proporcionados por Pfizer a la Agencia Europea de Medicamentos (EMA), se estudió la biodistribución de BNT162b2 en ratones y ratas mediante inyección intramuscular de LNP radiomarcado y modRNA de luciferasa. Se detectó radiactividad en la mayoría de los tejidos desde el primer momento (0,25 h), y los resultados mostraron que el lugar de la inyección y el hígado fueron los principales sitios de distribución, observándose concentraciones máximas entre 8 y 48 h después de la dosis [26]. Además, en los animales que recibieron la inyección de BNT162b2, se observaron efectos hepáticos reversibles, incluido agrandamiento del hígado, vacuolización, aumento de los niveles de gamma glutamil transferasa (γGT) y aumento de los niveles de aspartato transaminasa (AST) y fosfatasa alcalina (ALP) [26]. Los efectos hepáticos transitorios inducidos por los sistemas de administración de LNP se han informado anteriormente [27,28,29,30]; sin embargo, también se ha demostrado que el LNP vacío sin modRNA por sí solo no introduce ninguna lesión hepática significativa [27]. Por lo tanto, en este estudio, nuestro objetivo es examinar el efecto de BNT162b2 en una línea celular de hígado humano in vitro e investigar si BNT162b2 puede transcribirse inversamente en ADN a través de mecanismos endógenos.

2. Materiales y métodos

2.1. Cultivo de células

Se cultivaron células Huh7 (JCRB Cell Bank, Osaka, Japón) a 37 °C al 5% de CO2 con medio DMEM (HyClone, HYCLSH30243.01) suplementado con suero bovino fetal al 10% (v/v) (Sigma-Aldrich, F7524- 500 ML, Burlington, MA, EE. UU.) y penicilina-estreptomicina al 1 % (v/v) (HyClone, SV30010, Logan, UT, EE. UU.). Para el tratamiento con BNT162b2, se sembraron células Huh7 con una densidad de 200.000 células/pocillo en placas de 24 pocillos. La vacuna de ARNm BNT162b2 (Pfizer BioNTech, Nueva York, NY, EE. UU.) se diluyó con una inyección estéril de cloruro de sodio al 0,9%, USP, hasta una concentración final de 100 μg/ml como se describe en las pautas del fabricante [31]. Luego se añadió la suspensión de BNT162b2 en medios de cultivo celular para alcanzar concentraciones finales de 0,5, 1,0 o 2,0 μg/ml. Las células Huh7 se incubaron con o sin BNT162b2 durante 6, 24 y 48 h. Las células se lavaron minuciosamente con PBS, se recogieron mediante tripsinización y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.

2.2. RT-QPCR en tiempo real

El ARN de las células se extrajo con el RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, 74134, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. La RT-PCR se realizó utilizando el kit de síntesis de ADNc RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific, K1622, Waltham, MA, EE. UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. La qPCR en tiempo real se realizó utilizando Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, K0222, Waltham, MA, EE. UU.) con cebadores para BNT162b2, LINE-1 y genes de mantenimiento ACTB y GAPDH (Tabla 1).

Tabla 1. Secuencias de cebadores de RT-qPCR y PCR.

2.3. Tinción de inmunofluorescencia e imágenes confocales

Las células Huh7 se cultivaron en portaobjetos de ocho cámaras (LAB-TEK, 154534, Santa Cruz, CA, EE. UU.) con una densidad de 40.000 células/pocillo, con o sin BNT162b2 (0,5, 1 o 2 µg/ml) durante 6 h. La inmunohistoquímica se realizó utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón anti-LINE-1 ORF1p primario (Merck, 3574308, Kenilworth, NJ, EE. UU.), el anticuerpo secundario Cy3 Donkey anti-ratón (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU.) y Hoechst (Life technologies, 34850, Carlsbad, CA, EE. UU.), siguiendo el protocolo de Thermo Fisher (Waltham, MA, EE. UU.). Se tomaron dos imágenes por condición utilizando un Zeiss LSM 800 y un objetivo de inmersión en aceite de 63X, y la intensidad de la tinción se cuantificó en el área de células completas individuales y el área del núcleo en 15 células por imagen mediante ImageJ 1.53c. La intensidad de la tinción LINE-1 para el citosol se calculó restando la intensidad del núcleo de la de toda la célula. A todas las imágenes de las células se les asignó un número aleatorio para evitar sesgos. Para marcar los núcleos (determinados por la tinción de Hoechst) y las células completas (determinadas por los bordes de la fluorescencia LINE-1), se utilizó la herramienta de selección Freehand. Luego se midieron estas áreas y se utilizó la intensidad media para comparar los grupos.

2.4. Purificación de ADN genómico, amplificación por PCR, purificación en gel de agarosa y secuenciación de Sanger

El ADN genómico se extrajo de sedimentos celulares con tampón PBND (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, NP-40 al 0,45%, Tween-20 al 0,45%) de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente [32]. Para eliminar el ARN residual de la preparación de ADN, se añadió RNasa (100 µg/ml, Qiagen, Hilden, Alemania) a la preparación de ADN y se incubó a 37 °C durante 3 h, seguido de 5 min a 95 °C. Luego se realizó la PCR utilizando cebadores dirigidos a BNT162b2 (las secuencias se muestran en laTabla 1), con el siguiente programa: 5 min a 95 °C, 35 ciclos de 95 °C por 30 s, 58 °C por 30 s y 72 °C por 1 min; finalmente, 72 °C por 5 min y 12 °C por 5 min. Los productos de la PCR se procesaron en gel de agarosa al 1,4% (p/v). Se cortaron las bandas correspondientes a los amplicones del tamaño esperado (444 pb) y se extrajo el ADN utilizando el kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen, 28104, Hilden, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuencia del amplicón de ADN se verificó mediante secuenciación Sanger (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania).

Estadísticas

Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba t de Student de dos colas y ANOVA. Los datos se expresan como la media ± SEM o ± SD. Las diferencias con p < 0,05 se consideran significativas.

2.5. Declaraciones éticas

La línea celular Huh7 se obtuvo del banco de células de la Colección Japonesa de Biorrecursos de Investigación (JCRB).

3. Resultados

3.1. BNT162b2 ingresa a la línea celular de hígado humano Huh7 con alta eficiencia

Para determinar si BNT162b2 ingresa a las células hepáticas humanas, expusimos la línea celular de hígado humano Huh7 a BNT162b2. En un estudio previo sobre la cinética de absorción de la administración de LNP en células Huh7, la máxima eficacia biológica de LNP se observó entre 4 y 7 h [33]. Por lo tanto, en nuestro estudio, se cultivaron células Huh7 con o sin concentraciones crecientes de BNT162b2 (0,5, 1,0 y 2,0 µg/ml) durante 6, 24 y 48 h. Se extrajo ARN de las células y se realizó una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR) en tiempo real utilizando cebadores dirigidos a la secuencia BNT162b2, como se ilustra en la Figura 1. La secuencia completa de BNT162b2 está disponible públicamente [34] y contiene una tapa de dos nucleótidos; 5′- región no traducida (UTR) que incorpora la 5′-UTR de un gen de α-globina humana; la proteína S del SARS-CoV-2 de longitud completa con dos mutaciones de prolina; 3′-UTR que incorpora el segmento de ARNr 12S mitocondrial humano (mtRNR1) y el segmento del gen AES/TLE5 humano con dos mutaciones C→U; cola de poli(A). El análisis detallado de la secuencia de la proteína S en BNT162b2 reveló 124 secuencias que son 100% idénticas a las secuencias genómicas humanas y tres secuencias con un solo nucleótido (nt) que no coincide en 19 a 26 nts (Tabla S1, consulte Materiales complementarios). Para detectar el nivel de ARN de BNT162b2, diseñamos cebadores con un cebador directo ubicado en las regiones de la proteína S del SARS-CoV-2 y un cebador inverso en 3′-UTR, lo que permite la detección del amplicón de PCR exclusivo de BNT162b2 sin unión inespecífica de los cebadores a las regiones genómicas humanas.

Figura 1. Conjunto de cebadores de PCR utilizado para detectar el nivel de ARNm y la transcripción inversa de BNT162b2. La ilustración de BNT162b2 fue adaptada de la literatura descrita anteriormente [34].

Los resultados de RT-qPCR mostraron que las células Huh7 tratadas con BNT162b2 tenían niveles altos de ARNm de BNT162b2 en relación con los genes de mantenimiento a las 6, 24 y 48 h (Figura 2, presentada en 2-ΔΔCT registrado debido a niveles excepcionalmente altos). Las tres concentraciones de BNT162b2 condujeron a niveles de ARNm de BNT162b2 intracelular similares en los diferentes puntos temporales, excepto que la diferencia significativa entre 1,0 y 2,0 µg/ml se observó a las 48 h. Los niveles de ARNm de BNT162b2 disminuyeron significativamente a las 24 h en comparación con las 6 h, pero aumentaron nuevamente a las 48 h.

Figura 2. Niveles de ARNm de BNT162b2 en células Huh7 tratadas con BNT162b2. Las células Huh7 se trataron sin (Ctrl) o con 0,5 (V1), 1 (V2) y 2 µg/ml (V3) de BNT162b2 durante 6 (puntos verdes), 24 (puntos naranjas) y 48 h (puntos azules). . Se purificó el ARN y se realizó qPCR utilizando cebadores dirigidos a BNT162b2. Los niveles de ARN de BNT162b2 se presentan como valores registrados de 2 − ΔΔCT en relación con los genes de mantenimiento GAPDH y ACTB. Los resultados provienen de cinco experimentos independientes (n = 5). Las diferencias entre los respectivos grupos se analizaron mediante la prueba t de Student de dos colas. Los datos se expresan como la media ± SEM. (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 frente al control respectivo en cada momento, o como se indica).

3.2. Efecto de BNT162b2 sobre el elemento nuclear 1 intercalado largo de transcriptasa inversa endógena humana (LINE-1)

Aquí examinamos el efecto de BNT162b2 en la expresión del gen LINE-1. La RT-qPCR se realizó en ARN purificado de células Huh7 tratadas con BNT162b2 (0, 0,5, 1,0 y 2,0 µg/ml) durante 6, 24 y 48 h, utilizando cebadores dirigidos a LINE-1. Se observó un aumento significativo de la expresión de LINE-1 en comparación con el control a las 6 h con 2,0 µg/ml de BNT162b2, mientras que concentraciones más bajas de BNT162b2 disminuyeron la expresión de LINE-1 en todos los puntos temporales (Figura 3).

Figura 3. Niveles de ARNm de LINE-1 en células Huh7 tratadas con BNT162b2. Las células Huh7 se trataron sin (Ctrl) o con 0,5 (V1), 1 (V2) y 2 µg/ml (V3) de BNT162b2 durante 6 (puntos verdes), 24 (puntos rojos) y 48 h (puntos azules). . Se purificó el ARN y se realizó qPCR utilizando cebadores dirigidos a LINE-1. Los niveles de ARN de LINE-1 se presentan como valores 2 − ΔΔCT en relación con los genes de mantenimiento GAPDH y ACTB. Los resultados provienen de cinco experimentos independientes (n = 5). Las diferencias entre los respectivos grupos se analizaron mediante la prueba t de Student de dos colas. Los datos se expresan como la media ± SEM. (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 frente al control respectivo en cada punto de tiempo, o como se indica; † p < 0,05 frente a 6 h-Ctrl).

A continuación, estudiamos el efecto de BNT162b2 en el nivel de proteína LINE-1. El LINE-1 de longitud completa consta de una región no traducida (UTR) 5', dos marcos de lectura abiertos (ORF), ORF1 y ORF2, y una UTR 3', de la cual ORF1 es una proteína de unión a ARN con actividad chaperona. Se ha demostrado que la actividad de retrotransposición de LINE-1 implica la translocación de ORF1 al núcleo [35]. Las células Huh7 tratadas con o sin BNT162b2 (0,5, 1,0 y 2,0 µg/ml) durante 6 h se fijaron y se tiñeron con anticuerpos que se unían a LINE-1 ORF1p y una sonda Hoechst específica de ADN para la visualización del núcleo celular (Figura 4a). La cuantificación de la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia mostró que BNT162b2 aumentó los niveles de proteína LINE-1 ORF1p tanto en el área celular completa como en el núcleo en todas las concentraciones analizadas (Figura 4b-d).

Figura 4. Inmunohistoquímica de células Huh7 tratadas con BNT162b2 en distribución de proteínas LINE-1. Las células Huh7 se trataron sin (Ctrl) o con 0,5, 1 y 2 µg/ml de BNT162b2 durante 6 h. Las células se fijaron y se tiñeron con anticuerpos que se unían a LINE-1 ORF1p (rojo) y la sonda Hoechst específica de ADN para la visualización del núcleo celular (azul). ( a ) Imágenes representativas de la expresión de LINE-1 en células Huh7 tratadas con o sin BNT162b2. (b – d) Cuantificación de la proteína LINE-1 en el área celular completa (b), el citosol (c) y el núcleo (d). Todos los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional y los gráficos se crearon con GraphPad Prism V 9.2. Todos los datos se presentan como media ± DE (** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001 como se indica).

3.3. Detección de ADN BNT162b2 con transcripción inversa en células Huh7

Un estudio anterior ha demostrado que la entrada de la proteína LINE-1 al núcleo está asociada con la retrotransposición [35]. En el experimento de tinción por inmunofluorescencia descrito anteriormente, ya se observaron niveles elevados de LINE-1 en el núcleo a la concentración más baja de BNT162b2 (0,5 µg/ml). Para examinar si BNT162b2 se transcribe de forma inversa en ADN cuando LINE-1 está elevado, purificamos ADN genómico de células Huh7 tratadas con 0,5 µg/ml de BNT162b2 durante 6, 24 y 48 h. El ADN purificado se trató con RNasa para eliminar el ARN y se sometió a PCR utilizando cebadores dirigidos a BNT162b2, como se ilustra en la Figura 1. Luego, los fragmentos de ADN amplificados se visualizaron mediante electroforesis y se purificaron en gel (Figura 5). Se detectaron amplicones de ADN BNT162b2 en los tres puntos temporales (6, 24 y 48 h). La secuenciación de Sanger confirmó que los amplicones de ADN eran idénticos a la secuencia BNT162b2 flanqueada por los cebadores (Tabla 2). Para garantizar que los amplicones de ADN se derivaran de ADN pero no de ARN de BNT162b2, también realizamos PCR en ARN purificado de células Huh7 tratadas con 0,5 µg/ml de BNT162b2 durante 6 h, con o sin tratamiento con ARNasa (Ctrl 5 y 6 en la Figura 5). , y no se detectó ningún amplicón en las muestras de ARN sometidas a PCR.

Figura 5. Detección de amplicones de ADN de BNT162b2 en células Huh7 tratadas con BNT162b2. Las células Huh7 se trataron sin (Ctrl) o con 0,5 µg/ml de BNT162b2 durante 6, 24 y 48 h. El ADN genómico se purificó y se digirió con 100 µg/ml de RNasa. Se realizó PCR en todas las muestras con cebadores dirigidos a BNT162b2, como se muestra en la Figura 1 y la Tabla 1. Los amplicones de ADN (444 pb) se visualizaron en gel de agarosa. BNT: BNT162b2; L: escalera de ADN; Ctrl1: células Huh7 cultivadas; Ctrl2: células Huh7 sin tratamiento con BNT162b2 recolectadas a las 6 h; Ctrl3: células Huh7 sin tratamiento con BNT162b2 recolectadas a las 24 h; Ctrl4: células Huh7 sin tratamiento con BNT162b2 recolectadas a las 48 h; Ctrl5: ARN de células Huh7 tratadas con 0,5 µg/ml de BNT162b2 durante 6 h; Ctrl6: ARN de células Huh7 tratadas con 0,5 µg/mL de BNT162b2 durante 6 h, digeridas con RNasa.

Tabla 2. Resultado de la secuenciación de Sanger del amplicón BNT162b2.

4. Discusión

En este estudio presentamos evidencia de que la vacuna de ARNm BNT162b2 de COVID-19 puede ingresar a la línea celular de hígado humano Huh7 in vitro. El ARNm de BNT162b2 se transcribe de forma inversa intracelularmente en ADN tan rápido como 6 h después de la exposición a BNT162b2. Un posible mecanismo para la transcripción inversa es a través de la transcriptasa inversa endógena LINE-1, y BNT162b2 eleva la distribución de proteínas del núcleo de LINE-1.

La acumulación intracelular de LNP en hepatocitos se ha demostrado in vivo [36]. Un estudio preclínico sobre BNT162b2 mostró que BNT162b2 ingresa a la línea celular humana HEK293T y conduce a una expresión robusta del antígeno BNT162b2 [37]. Por lo tanto, en este estudio, investigamos primero la entrada de BNT162b2 en la línea celular Huh7 del hígado humano. La elección de las concentraciones de BNT162b2 utilizadas en este estudio merece una explicación. BNT162b2 se administra en una serie de dos dosis con tres semanas de diferencia, y cada dosis contiene 30 µg de BNT162b2 en un volumen de 0,3 ml, lo que hace que la concentración local en el lugar de la inyección sea máxima de 100 µg/ml [31]. Un estudio previo sobre vacunas de ARNm contra los virus de la influenza H10N8 y H7N9 que utiliza un sistema de administración LNP similar mostró que la vacuna de ARNm puede distribuirse de manera bastante inespecífica a varios órganos como el hígado, el bazo, el corazón, los riñones, los pulmones y el cerebro, y la concentración en el el hígado es aproximadamente 100 veces menor que el del lugar de la inyección intramuscular [38]. En el informe de evaluación de BNT162b2 proporcionado a la EMA por Pfizer, los estudios de distribución farmacocinética en ratas demostraron que una proporción relativamente grande (hasta el 18%) de la dosis total se distribuye en el hígado [26]. Por lo tanto, optamos por utilizar 0,5, 1 y 2 μg/ml de vacuna en nuestros experimentos con células hepáticas. Sin embargo, el efecto de un rango más amplio de concentraciones más bajas y más altas de BNT162b2 también debería verificarse en estudios futuros.

En el estudio actual, empleamos una línea celular de hígado humano para la investigación in vitro. Vale la pena investigar si las células del hígado también presentan la proteína de pico del SARS-CoV-2 derivada de la vacuna, lo que potencialmente podría convertir a las células del hígado en objetivos para las células T citotóxicas reactivas a la proteína de pico previamente preparadas. Ha habido informes de casos de personas que desarrollaron hepatitis autoinmune [39] después de la vacunación BNT162b2. Para obtener una mejor comprensión de los efectos potenciales de BNT162b2 sobre la función hepática, se desean modelos in vivo para estudios futuros.

En el informe de toxicidad del BNT162b2 no se han proporcionado estudios de genotoxicidad ni de carcinogenicidad [26]. Nuestro estudio muestra que BNT162b2 puede transcribirse inversamente a ADN en la línea celular hepática Huh7, y esto puede generar preocupación si el ADN derivado de BNT162b2 puede integrarse en el genoma del huésped y afectar la integridad del ADN genómico, lo que potencialmente puede mediar en la genotoxicidad. efectos secundarios. En esta etapa, no sabemos si el ADN con transcripción inversa de BNT162b2 está integrado en el genoma celular. Se necesitan más estudios para demostrar el efecto de BNT162b2 sobre la integridad genómica, incluida la secuenciación del genoma completo de células expuestas a BNT162b2, así como tejidos de sujetos humanos que recibieron la vacuna BNT162b2.

El retrotransposón autónomo humano LINE-1 es una transcriptasa inversa endógena celular y el único transposón activo que queda en humanos, capaz de retrotransponerse a sí mismo y a otros elementos no autónomos [40,41], y ~17% del genoma humano está compuesto por secuencias LINE-1. [42]. Los elementos Alu no autónomos, los elementos de nucleótidos cortos intercalados (SINE), el número variable de repeticiones en tándem (VNTR), así como los pseudogenes procesados ​​por ARNm celular, son retrotranspuestos por las proteínas de retrotransposición LINE-1 que trabajan en trans [43 ,44]. Un estudio reciente demostró que el LINE-1 endógeno media la transcripción inversa y la integración de secuencias del SARS-CoV-2 en los genomas de células humanas infectadas [25]. Además, la expresión de LINE-1 endógeno a menudo aumenta con la infección viral, incluida la infección por SARS-CoV-2 [45,46,47]. Estudios anteriores demostraron que la actividad de retrotransposición de LINE-1 está regulada por el metabolismo del ARN [48,49], la respuesta al daño del ADN [50] y la autofagia [51]. La retrotransposición eficiente de LINE-1 a menudo se asocia con el ciclo celular y la ruptura de la envoltura nuclear durante la mitosis [52,53], así como con retrovirus exógenos [54,55], que promueven la entrada de LINE-1 al núcleo. En nuestro estudio, observamos una mayor distribución de LINE-1 ORF1p según lo determinado por inmunohistoquímica en el núcleo por BNT162b2 en todas las concentraciones analizadas (0,5, 1 y 2 μg/mL), mientras que se detectó una expresión elevada del gen LINE-1 en el nivel más alto de BNT162b2. concentración (2 μg/mL).Vale la pena señalar que la transcripción genética está regulada por modificaciones de la cromatina, la regulación de los factores de transcripción y la tasa de degradación del ARN, mientras que la regulación traduccional de las proteínas implica el reclutamiento de ribosomas en el codón de iniciación, la modulación del alargamiento de los péptidos, la terminación de la síntesis de proteínas o la biogénesis de los ribosomas. . Estos dos procesos están controlados por mecanismos diferentes y, por lo tanto, es posible que no siempre muestren los mismos patrones de cambio en respuesta a desafíos externos. La regulación exacta de la actividad de LINE-1 en respuesta a BNT162b2 merece más estudio.

El modelo celular que utilizamos en este estudio es una línea celular de carcinoma, con replicación activa del ADN que difiere de las células somáticas que no se dividen. También se ha demostrado que las células Huh7 muestran una expresión de genes y proteínas significativamente diferente, incluidas proteínas reguladas al alza implicadas en el metabolismo del ARN [56]. Sin embargo, la proliferación celular también es activa en varios tejidos humanos, como la médula ósea o las capas basales de epitelios, así como durante la embriogénesis, por lo que es necesario examinar el efecto de BNT162b2 sobre la integridad genómica en tales condiciones. Además, también se ha informado de una retrotransposición eficaz de LINE-1 en células que no se dividen y diferenciadas terminalmente, como las neuronas humanas [57,58].

El informe de evaluación de Pfizer EMA también mostró que BNT162b2 se distribuye en el bazo (<1,1%), las glándulas suprarrenales (<0,1%), así como una radiactividad baja y mensurable en los ovarios y los testículos (<0,1%) [26]. Además, no se dispone de datos sobre la transferencia placentaria de BNT162b2 en el informe de evaluación de Pfizer EMA. Nuestros resultados mostraron que el ARNm de BNT162b2 ingresa fácilmente a las células Huh7 a una concentración (0,5 µg/ml) correspondiente al 0,5% de la concentración local en el sitio de inyección, induce cambios en la expresión del gen y la proteína LINE-1 y, en 6 h, la transcripción inversa de BNT162b2. puede ser detectado. Por tanto, es importante investigar más a fondo el efecto de BNT162b2 en otros tipos de células y tejidos tanto in vitro como in vivo.

5. Conclusions

Our study is the first in vitro study on the effect of COVID-19 mRNA vaccine BNT162b2 on human liver cell line. We present evidence on fast entry of BNT162b2 into the cells and subsequent intracellular reverse transcription of BNT162b2 mRNA into DNA.

Supplementary Materials

The following supporting information can be downloaded at: https://www.mdpi.com/article/10.3390/cimb44030073/s1.

Author Contributions

M.A., F.O.F., D.Y., M.B. and C.L. performed in vitro experiments. M.A. and F.O.F. performed data analysis. M.R. and Y.D.M. contributed to the implementation of the research, designed, and supervised the study. Y.D.M. wrote the paper with input from all authors. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.

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